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CNS热点、国自然热门,m6A的前世今生

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CNS热点、国自然热门,m6A的前世今生

解螺旋 解螺旋 2020-05-21



解螺旋公众号·陪伴你科研的第2213天


m6A修饰全面综述


近年来,m6A RNA修饰的研究已成为当今生命科学领域最前沿最热门的研究方向之一,不断有CNS的文章问世,国自然资助的项目数量也逐年上升。


m6A是什么,m6A调控因子、m6A检测方法有哪些,m6A在人类疾病中扮演哪些作用。本文将做一简明阐述。


m6A概念


N6-methyladenosine也叫m6A,是一种广泛存在于mRNA上的碱基修饰行为,mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。


mRNA最常见的内部修饰包括了N6-腺苷酸甲基化(m6A)、N1-腺苷酸甲基化(m1A)、胞嘧啶羟基化(m5C)等。N6-甲基腺嘌呤(m6A)在 mRNA 内部修饰碱基中所占比例最大,主要分布在 G(m6A)C (70%)或者A(m6A)C (30%)保守序列中。


早在20世纪70年代,Desrosiers. R等在人哺乳动物细胞的 mRNA 中发现了m6A的存在,但m6A的功能以及作用机制却一直鲜有研究。

直到 2011 年,芝加哥大学何川教授团队在 Nat Chem Biol 发表文章“N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO”,揭示m6A的可逆化修饰,使 m6A 的研究重新热门起来。


图1 RNA常见的碱基修饰行为


m6A的分子改变是什么?从图2中我们可以看到,这是一个已经发生甲基化的核糖核苷酸,确切地说叫N6-methyladenosine。一共分为2个大的结构,左下角的是五碳糖,图2中a框部分也就是五碳糖的第二位C处的羟基发生脱氧就会变成脱氧核糖核苷酸(从RNA变成DNA)。图2中c框部分标注的,也就是第四位的C处通常会带有磷酸基。图2中b框部分通常就是我们所说的含氮碱基。这里特指腺苷酸(A),当腺苷酸的第六位N处发生甲基化时,就是我们所说的m6A。

图2 N6-甲基化腺苷酸结构示意图


m6A调控因子


m6A这种甲基化修饰是可逆化的,调控因子包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白等。甲基化转移酶包括METTL3/14、WTAP和KIAA1429等,主要作用是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。而去甲基化酶包括FTO和ALKHB5等,作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰。阅读蛋白主要功能是识别发生m6A修饰的碱基,从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。


图3 参与m6A的酶类

图4 m6A调控


甲基化转移酶(methyltransferase)也称为Writers,能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1492都属于m6A甲基化转移酶的核心蛋白。这些蛋白会形成复合物(complex),共同行使催化功能。

图5 METTL3、METTL14及其复合物结构


m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5等。FTO蛋白全称Fat mass and obesity-associated protein,属于Alkb蛋白家族中的一员并且与肥胖相关。2011年,芝加哥大学何川教授团队首次证实, FTO蛋白是一种重要的去甲基化酶。ALKBH5是另一种重要的去甲基化酶,对细胞核中的mRNA进行去甲基化修饰。在细胞系中敲低ALKBH5后,mRNA上m6A修饰水平显著上升。


发生m6A修饰的mRNA想要行使特定的生物学功能,需要甲基化阅读蛋白,也称为reader。阅读蛋白主要包括YTH结构域的蛋白、核不均一核糖蛋白(hnRNP)以及真核起始因子(eIF)等。这些阅读蛋白的功能主要包括特异性结合m6A甲基化区域,削弱与RNA结合蛋白同源结合以及改变RNA二级结构从而改变蛋白与RNA的互作。


m6A检测方法



目前检测m6A所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用(LC-MS),常用的方法主要包括MeRIP-seq、miCLIP-seq、LC-MS/MS以及比色法。其中LC-MS/MS和比色法能够检测mRNA整体的m6A水平,而MeRIP-seq和miCLIP-seq属于高通量测序手段。


LC-MS/MS在液相质谱的基础上采用串联质谱,获得分子离子峰和碎片离子峰,对碱基同时进行定性和定量分析。

LC-MS/MS法第一步使用TRIzol提取完总 RNA后,可以用oligodT磁珠或者rRNA去除试剂盒获得包括mRNA、lncRNA等在内的RNA。

第二步使用核酸酶P1(Nuclease P1)将RNA消化成单个碱基。

第三步加入碱性磷酸酶和碳酸氢铵后孵育数小时,将样本注射入液相色谱仪,计算各个碱基的含量。

第四步进入质谱串联分析,单个核糖核苷酸会被打断成五碳糖和嘧啶或嘌呤。最后根据m6A和总腺嘌呤的比例就能算出m6A在mRNA上整体的甲基化程度。


LC-MS/MS为最早检测m6A的方法,操作较为繁琐。相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作,比色法更为简便。研究人员既可以提取total RNA,也可以利用oligodT磁珠富集mRNA。


图6 m6A检测方法 (A)LC-MS/MS法;(B)比色法。


2012年之前,全基因组或全转录组水平上鉴定m6A修饰的研究领域是一片空白。2012年Meyer K. D发表于Cell上的论文“Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons”和Dominissini D发表于Nature上的论文“Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq”第一次从转录水平上,大范围、高通量地鉴定了人和小鼠m6A的甲基化水平。


这种方法被称为MeRIP-seq或m6A-seq。

MeRIP-seq操作第一步先对mRNA进行片段化,接下来使用带有m6A抗体的免疫磁珠对发生m6A甲基化的mRNA片段进行富集,然后将富集到的mRNA片段纯化后构建高通量测序文库进行上机测序。另外需要单独构建一个普通的转录组文库作为对照。最后将2个测序文库放在一起进行生物信息学分析,得到m6A甲基化程度较高的区域(m6A peak)。


这种方法优点是方便快捷成本低廉,可以对发生高甲基化的mRNA区域进行一个定性分析。但是MeRIP-seq只能鉴定m6A高甲基化的区域,并不能做到单碱基的分辨率。


2015年,Bastian Linder等发表在Nature Methods的文章“Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome”,第一次从单碱基的水平测定m6A。


这种技术被称为miCLIP-seq。

miCLIP-seq操作第一步对富集完的mRNA进行片段化。

第二步,使用带有m6A抗体免疫磁珠与带有m6A的mRNA片段进行结合。

第三步,使用紫外交联进行免疫共沉淀后,在mRNA片段的3’端连上接头序列,在5’端加上P32放射性标记后进行移膜。

第四步,根据放射性标记进行切膜回收后,对mRNA片段进行反转录和纯化回收。

第五步,对反转录组的cDNA进行环化。

第六步,对环化的cDNA进行复线性化,然后构建测序文库上机测序。


图7 高通量测序检测m6A (A)MeRIP-seq;(B)miCLIP-seq


m6A在疾病中的研究热点(2020年)


1. 肿瘤

2020年3月发表于Cancer Cell上的综述性文章“m6A Modification in Coding and Non-coding RNAs: Roles and Therapeutic Implications in Cancer”,文章指出,m6A相关修饰酶在肿瘤中的变化不尽相同,环境改变和位点突变均可导致m6A状态的改变,同时m6A参与一些肿瘤靶向治疗基因的调控。


图8 m6A相关修饰酶在肿瘤中的变化


2. 病毒感染

2020年2月发表于Nature Microbiology上的文章“N6-methyladenosine modification enables viral RNA to escape recognition by RNA sensor RIG-I”,文章指出,人类偏肺病毒(HMPV)在其RNA中获得m6A,可以模仿正常细胞的RNA,躲避免疫系统的检测。


图9 病毒中m6A的作用


3. 神经脱髓鞘改变

2020年1月发表于Neuron上的文章“m6A mRNA Methylation Is Essential for Oligodendrocyte Maturation and CNS Myelination”,文章指出,m6A去甲基化酶METTL14的减少会导致少突胶质细胞的减少及中枢神经的脱髓鞘改变,提示m6A在神经细胞的发育中起着重要的调节作用。


图10 m6A对神经系统发育的调控。


m6A的研究热点不断升级,今后会有更多的高分文章出现,关联的疾病也会越来越多。

但是,m6A的检测方法较为繁琐,所需费用也比较高,限制的m6A的研究进展以及临床应用,发展快速简便经济的检测方法是今后m6A检测技术的发展方向。

同时在研究层面,m6A作为十分重要的 RNA 表观遗传学修饰,如何与 DNA、组蛋白表观遗传学协同作用调控基因表达,也需要进一步深入探索。


参考文献
  1. Barbieri, I., Kouzarides, T. Role of RNA modifications in cancer. Nat Rev Cancer (2020). doi:10.1038/s41568-020-0253-2.

  2. Roundtree IA, Evans ME, Pan T, et, al. Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation. Cell. 2017;169(7):1187-1200. doi: 10.1016/j.cell.2017.05.045.

  3. Lee M , Kim B , Kim V. Emerging Roles of RNA Modification: m6A and U-Tail. Cell, 2014, 158(5):980-987. doi: 10.1016/j.cell.2014.08.005.

  4. WangX , Feng J , Xue Y , et al. Structural basis of N6-adenosine methylation by theMETTL3–METTL14 complex. Nature, 2017, 542(7640):260-269. doi:10.1038/nature18298.

  5. KathrinThüring, Katharina Schmid, Patrick Keller. LC-MS Analysis of Methylated RNA.2017. Doi: 10.1007/978-1-4939-6807-7_1.

  6. Dominissini D , Moshitch-Moshkovitz S , Schwartz S ,et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed bym6A-seq[J]. Nature, 2012, 485(7397):201-206.doi: 10.1038/nature11112.

  7. Linder Bastian, Grozhik Anya V, Olarerin-George,et,al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout thetranscriptome[J]. Nature Methods, 2015, 12(8):767-772.doi: 10.1038/nmeth.3453.

  8. HuangH , Weng H , Chen J . m6A Modification in Coding and Non-coding RNAs: Roles andTherapeutic Implications in Cancer. Cancer Cell, 2020, 37(3):270-288. doi:10.1016/j.ccell.2020.02.004.

  9. Lu, M., Zhang, Z., Xue, M. et al. N6-methyladenosinemodification enables viral RNA to escape recognition by RNA sensor RIG-I. NatMicrobiol 5, 584–598 (2020). Doi: 10.1038/s41564-019-0653-9

  10. Xu H , Dzhashiashvili Y , Shah A , et al. m6A mRNAMethylation Is Essential for Oligodendrocyte Maturation and CNS Myelination.Neuron, 2019, 105(2).115-131. Doi: 10.1016/j.neuron.2019.12.013.


END

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